谁做过脂肪细胞的原代培养？
DMEM-ADMEM-B胶原酶雄性大鼠
试剂和试剂盒
KRBH缓冲器KRBH-A缓冲器
仪器和耗材
培养皿锥形离心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龙过滤嘴解剖剪佩里镊子塑料盒干草切割器移液管
实验步骤
首先，切除附睾脂肪垫
1.当充入70%的二氧化碳时？还有30%的氧气。大鼠(Sprague-Dawley雄性大鼠:145~170 g，CD系列)在混合气体的塑料盒中麻醉。
2.用铡草机断头出血。
3.将老鼠浸泡在70%的乙醇中一会儿。
4.尽量在无菌条件下取出附睾脂肪垫。
(a)用手术刀切开下腹部皮肤，露出腹膜。
(b)用另一把解剖剪刀切开腹膜，然后用Perry镊将睾丸向上拉。
(c)切开附睾脂肪垫，注意保存血管。
5.将组织转移到培养实验室。
消化并洗涤来自脂肪细胞的胶原酶(向2 ml KRBH缓冲液中加入20 mg/ml胶原酶，然后用0.22微米过滤器过滤)。
6.将4 g脂肪垫(相当于8个附睾脂肪垫)放入4 ml KRBH缓冲液(Krebs-Ringer溶液，pH 7.4)，加入10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES(适马)、200 nmol/L腺苷(Boche)和1%。配制1 L KRBH缓冲液时，7 g NaCl，0.55 g KH2PO4，0.25 g MgSO4？7H2O，0.84 g NaHCO3，0.11 g CaCl2，7.15 g HEPES，10 g BSA，1 ml 200 μmol/L腺苷，加超纯水至1 L，然后，按100 ml包装。使用前，将其加热至37°C，并将pH值调节至7.4。)(37℃)，装在30毫升低密度聚丙烯瓶中。
7.将脂肪垫切成直径约2 mm的组织块。
8.将组织块放入瓶中，然后加入1 ml胶原酶溶液。在37°C水浴振荡器中培养约65438±0小时，直到细胞混合物形成乳脂状粘稠液体。
9.胶原酶消化后，向瓶中加入4 ml KRBH缓冲液(37°C)。
10.通过搅拌混合瓶中的细胞，然后将细胞轻轻过滤到带有孔径为250微米的尼龙筛网的50毫升锥形离心管中(置于支持物或漏斗中)。
11.向离心管中加入30毫升KRBH缓冲液(37°C ),清洗细胞。用台式离心机短时间离心(200 g)，然后用吸管吸出上清液。注意脂肪细胞漂浮在水性缓冲液的上面。
12.通过加入40 ml KRBH缓冲液洗涤细胞，离心并去除上清液。重复此步骤1次。
13.使用40毫升DMEM-A (DMEM，pH 7.4)，加入25毫摩尔/升葡萄糖，2毫摩尔/升谷氨酰胺，200毫摩尔/升(R)-N6-(L-甲基-2-苯基乙基)腺苷(PIA，适马)和6544。根据100 ml进行分装，加热至37°C(37°C)，并在使用前清洗电池两次。
14.用大约40%的细胞因子DMEM-A悬浮漂浮的细胞
第二，脂肪细胞的原代培养
15.用200 μl大口径移液管将2ml 40% cyto crit DMEM-A悬浮液转移到60 mm培养皿中。
16.将培养皿放在37℃和5% CO2的潮湿培养箱中。在1.5 h的条件下
17.向培养皿中加入5毫升DMEM-B (DMEM-A，7%牛血清白蛋白)。
此时应进行葡萄糖摄取试验[Quom 1998]检查细胞活力。
-
中山医科大学学报(Acadjsum)，2001，22 (6): 443 ~ 446443。
人前脂肪细胞的原代培养
1，2，李？严2，杨1，匡1。
(中山医科大学？1.孙逸仙纪念医院妇产科，2。广东广州生物系？510120)
挑？想要:？目的建立人前脂肪细胞的原代培养方法，为进一步研究人脂肪组织增生的生物学特性奠定基础。？方法选取成人腹部脂肪组织，采用原代消化细胞培养法培养棱形细胞。同时取皮肤组织培养作为对照。？结果培养的棱形细胞成分均匀，增殖旺盛，分化率高。通过形态学动态变化观察、生长曲线和油红O脂肪染色提取法，证明其为活跃的前脂肪细胞，并在体外再现了其增殖的全过程。？结论成熟脂肪组织中存在能够分化成熟并产生脂肪的前脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一，本实验为进一步研究肥胖和胰岛素抵抗相关疾病如多囊卵巢综合征奠定了基础。
关键词:前脂肪细胞；细胞培养；脂肪组织
中国图书馆分类号:Q254，R711.75？文件识别码:a？文章编号:1000-257 x(2001)06-0443-04。
primarycultureofhumanpredipocyte
王铸？陈1，？中2，李炎2，阳东？zi1，狂剑？quan1
(1.中山大学妇产科。纪念医院，2。生物系，
SunYat？中国广州医学科学院大学，510120)
摘要:？目的建立原代人前脂肪细胞培养方法，以更好地了解人前脂肪细胞的特性。？方法采用原代细胞培养，成纤维细胞？就像培养的细胞一样。结果细胞高度均一、增殖、分化率高。他们的动态形态变化，生长曲线，提取stainedintracytopsilclipid with oil redo，all verified theirpreipocyteidentity。在受控条件下，preipocytesreplayedtherhyperplasiaprocessinvitro。？结论在成人脂肪沉积组织中，存在前脂肪细胞和分化脂肪细胞。由于脂肪细胞sonekindofclassictargetcellstoinsulin，这项研究laidthebasisforfur？therpropingintoobesityandinsulinresistant diseases ssuchasycysticovarysyndrome。
关键词:前脂肪细胞；细胞培养；脂肪组织
脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一，并且
肥胖和胰岛素抵抗相关疾病，如多囊卵巢综合征
研究密切相关，近年来在妇科内分泌领域受到较多关注。
看吧。前脂肪细胞是一类具有增殖和分化成脂肪细胞的细胞。
趋化能力的特化前体细胞，它的存在和功能继续。
在人类生活中，我们已经从人类脂肪组织中培养出前脂肪细胞。
细胞为进一步研究奠定了基础。
收到日期:2001-04-23
基金项目:广东省卫生厅科研基金资助(2001189)
,;1?材料和方法1.1？从2000年9月到2006年9月5438+0，1，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438剖腹手术中获取皮下脂肪组织和皮肤组织。
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1.2?试验材料
1.2.1?主要测试用品和化学试剂？DMEM/F？12中等(1！1)、无支原体胎牛血清、A型胶原酶、Hepes、人转铁蛋白、青霉素、链霉素均购自GIBCO公司。生物素、泛酸、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸(T3)、3？异丁基？1?甲基黄嘌呤是SIGMA公司的产品。牛血清白蛋白购自罗氏公司。实验所需的无机试剂购自广州医药公司化学检测批发部，均为分析纯试剂。培养瓶购自KORNING公司。
1.2.2?培养基和主要试剂的准备？培养基A[1]中山医科大学学报(Acadjsum)，2001，22 (6)培养基A制成细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，密度为3？65，438+00细胞在体积分数为5%的37# CO2培养箱中孵育65，438+06h。之后，PBS轻轻洗去培养瓶中未粘附的物质，用培养基C诱导并维持脂肪细胞分化。3天后换成B培养基，之后每隔2 ~ 3天换成B培养基。1.3.2?人前脂肪细胞和皮肤成纤维细胞的组织学染色？把盖玻片切成0？5cm？1?0cm大小，接种时置于培养瓶中，待细胞贴壁后每隔2、3天取出培养瓶进行染色。将脂肪细胞朝上的一侧浸入体积分数中。
在编号为10%甲醛的等渗盐缓冲液中固定10min，然后放入PBS缓冲液中，轻轻冲洗一会儿，直立使残留的水流到边缘，用吸水纸吸干。稍加干燥后，人类前脂肪细胞由苏丹红%制成？& amp细胞核滴染和迈尔苏木精双染，甘油明胶密封；皮肤成纤维细胞苏木精伊红染色，脱水透明，中性树脂密封，光镜观察，拍照保存结果。
1.3.3?细胞生长曲线的绘制？将细胞悬液接种于24个培养瓶中，随机分成8组，每组3瓶。每2天检测一组中每瓶的细胞总数，取3瓶的平均值，以此结束第八组。细胞计数法参考医学细胞生物学实验[3]。
1.3.4?油红O染色提取法测定细胞内脂肪含量？接种方法同1.3.3。根据Ramirez[2]4:取DMEM/F？5g 12培养粉，加入胎牛血清使其体积分数为10%，三重蒸馏水体积为500mL中号b:按照说明服用DMEM/F？12培养粉10g，终浓度15mmol/lnahco3和15mmol/lhep？es，33？Mol/L泛酸，17？Mol/L人转铁蛋白，100000U/L青霉素，0？1g/L链霉素，100nmol/L氢化可的松，60nmol/L胰岛素，0？2nmol/LT3，三重蒸馏水定容至1000ml；培养基c:取200mL培养基a，加入3？异丁基？1?甲基黄嘌呤，使其最终浓度为0？25 mmol/L；消化液:称取胶原酶(？150mg型，牛血清白蛋白2g，0？0.1 mol/L磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)至100ml；红细胞裂解缓冲液:称取适量NH4Cl、K2HPO4和EDTA，使其终浓度为154mmol/L，5？7mmol/L和0？1mmol/L，三重蒸馏水
将体积固定为250毫升。以上溶液均已调至pH 7？4~7?6,0?22?m微孔滤膜正压过滤除菌，包装后-30#保存。油红o工作液[2]等。培养物用体积分数为10%甲醛的等渗盐水缓冲液固定1h，然后用蒸馏水冲洗。吸取10mL油红O工作液，将培养面朝下，2小时后将瓶中的油红O倒出。
用工作溶液和蒸馏水冲洗培养瓶数次，直至其完全漂浮。将染色后的培养瓶放入32#培养箱中蒸发瓶内水分，然后加入1mL异丙醇，立即用吸管吸去萃取后的染料溶液，用HITACHIG2000分光光度计在波长510nm处测量吸光度。:体重4？将2g油红O溶解在1200mL异丙醇中，并在室温下静置过夜。用分析滤纸过滤后收集滤液，加入900mL三重蒸馏水。再次在4号静置过夜后，可在室温下保存备用。1.2.3?乐器？设备？CO2培养箱、倒置显微镜等。1.3?方？法律
1.3.1?人前脂肪细胞和皮肤成纤维细胞的原代培养[1]？手术过程中，约60g脂肪组织和约0？5cm？3cm用于成纤维细胞培养作为对照。PBS洗涤，分离去除脂肪组织中可见的纤维成分和血管，皮肤组织需要去除表皮和皮下脂肪，切成2mm左右？2mm小块，加入消化液，置于体积分数为5%的37# CO2培养箱中消化。15h后，200？g短时间离心去除漂浮的脂肪细胞和培养基，将沉淀的细胞用红细胞裂解缓冲液再次制备成细胞悬液，37#孵育10min去除污染的红细胞，150？2?打结？2.1?原代培养人前脂肪细胞和皮肤成纤维细胞的形态学观察:细胞贴壁后起初呈小圆形，核浆比大(图1？1)，4天后观察到细胞逐渐呈梭形，7天左右棱形细胞大量增生，在培养瓶底部面积达到1/2后开始堆积脂肪颗粒(图1？2)。第9天，观察到细胞逐渐由棱形变为椭圆形或圆形(图1？3)、堆积着脂肪颗粒
第六期？王珠臣等。人类前脂肪细胞445脂肪细胞的原代培养(图1？4)。体外培养的脂肪细胞体积大，细胞膜薄，膜轮廓不光滑、不均匀、有皱褶。细胞质中有大量圆形脂滴，大小不一，呈散在状。也有大量小脂滴结合成大脂滴的情况，细胞核仍在边缘。同时，培养的皮肤成纤维细胞增殖速度相似，但始终呈长棱形，无脂滴堆积(图2？1，图二？2)。
2.2?人前脂肪细胞和皮肤成纤维细胞的生长曲线
从生长曲线可以看到人前脂肪细胞(图3？1)和皮肤成纤维细胞(图3？2)的倍增时间分别为60h和55h。
。3?拜托了。3.1上？人前脂肪细胞培养在妇科内分泌学中的研究意义:脂肪细胞是脂肪组织的重要组成部分，是其功能的主体。当代研究认为，脂肪组织中的脂肪细胞非常活跃，细胞的数量、形态和细胞内脂肪含量处于动态变化中，并终生保持。肥胖被认为是脂肪细胞不受控制的增殖和分化的结果。目前，胖
肥胖已经成为与妇科内分泌密切相关的疾病。肥胖可产生胰岛素抵抗/高胰岛素血症，这是许多临床疾病或症状的相同危险信号，尤其是常见的内分泌和代谢疾病如糖尿病、高血压和动脉粥样硬化，因此近年来成为许多医学学科同样感兴趣的研究热点。尤其是近年来，研究发现
图3.1？人前脂肪细胞生长曲线
图3.1？人前脂肪细胞生长曲线
培养胰岛素抵抗/高胰岛素血症也与育龄妇女高雄激素血症和无排卵有关。多囊卵巢综合征，
约5%~10%的育龄妇女患有此病，常伴有肥胖，病因不明。目前认为多囊卵巢综合征是一种以胰岛素抵抗为特征的内分泌代谢疾病，继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症在引起高雄激素血症和不孕的体征中起重要作用[4]。脂肪细胞充当胰岛素抑制剂。
图3.2？人皮肤成纤维细胞的生长曲线
图3.2？人皮肤纤维化生长曲线是敏感的靶细胞之一，因此研究其潜在的胰岛素抵抗机制具有特殊的临床意义。前脂肪细胞体外培养
全面了解脂肪组织发生和增殖的全过程，直接观察各种因素对这一过程的调控并研究其机制，是研究脂肪组织的理想模型。虽然国外已经建立了小鼠前脂肪细胞来源的细胞系，如3T3？L1、3T3？F442A，ob17系列等。，但到目前为止，还没有建立人前脂肪细胞株[5]，限制了进一步的研究。
3.2?体外培养人前脂肪细胞的生物学特性
目前国内外前脂肪细胞体外培养体系有两种，一种是来源于血管基质成分细胞(stromalvas？分子分数(SVF)，这是一个典型的前脂肪细胞。Van等人[6]系统研究了SVF，形成了完整的前脂肪细胞理论。他们用胶原酶处理切割的脂肪组织，然后离心组织悬液，其中沉淀基质血管成分是SVF，并培养SVF。与培养的成纤维细胞相比，两种培养物增殖速度相同，倍增时间约为55小时。在显微镜下对比细胞，发现起初2.3？前脂肪细胞和皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化。前脂肪细胞中的脂肪含量在培养9天后迅速增加，在大约16d时达到峰值，而皮肤成纤维细胞中仅有少量脂肪堆积(图4)。
。图4？前脂肪细胞和皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化。前脂肪细胞和皮肤成纤维细胞在培养中的变化
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成纤维细胞胞质内可积聚大量脂滴，但无或仅有少量脂滴。这证明SVF是具有增殖和分化成脂肪细胞潜能的前脂肪细胞。本实验研究的结果与它们一致，也与文献[6]提出的三个标准一致。此外，近年来也有报道称，脂肪组织块与天花板培养相结合的方法也获得了成功[7]。该方法获得的前脂肪细胞不同于SVF，可能来源于Carraro等在成熟脂肪细胞中发现的细胞岛，但该方法是在血清中培养，与成熟脂肪细胞一起孵育，不适合成熟脂肪细胞分泌的某些细胞因子的体外研究模型。
前脂肪细胞的培养阐明了增殖和分化之间的关系，目前认为是生长停顿？再次成长？细胞分化的连续关系。生长暂停是必要的第一步，在此之后，这些细胞在继续转化为成熟的脂肪细胞之前至少还要经历一次分裂。甘油会随着时间的推移出现吗？3?磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA是一种晚期标记物，也是脂肪合成所必需的限速酶，最终成为脂肪细胞。我们的研究还观察到，细胞经过一段时间的孵育后开始生长，大约3、5天增殖，1周后开始积累脂肪颗粒。培养2周后，脂肪细胞分化为脂滴或脂滴，与文献报道一致。
油红O染色提取法可简单快速地定量体外培养前脂肪细胞的转化率。文献中报道的准确度和灵敏度与GPDH相似，后者是测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶[2]。因此，常被用于鉴定体外培养的前脂肪细胞。在胰岛素和氢化可的松的作用下，体外培养的前脂肪细胞的GPDH开始上升并迅速增加，在8天左右达到高峰并维持在较高水平[2]。我们采用油红O染色提取法进行研究。结果表明，前脂肪细胞在培养第3天开始积累脂肪，1周后积累量明显增加，2周时达到高峰，与形态学培养1周后细胞内出现脂肪颗粒相一致。也说明酶的出现在先，脂肪的出现在后，细胞内脂肪含量的明显增加比GPDH晚约1周，与文献报道一致[2]。
3.3?人前脂肪细胞培养技术的特点
脂肪组织来源于原始网状结缔组织，由结缔组织和脂肪细胞组成。脂肪细胞是主要的细胞成分，此外还有网状细胞、间充质细胞、组织细胞、内皮细胞等。脂肪细胞和成纤维细胞都来自中胚层，所以培养的脂肪细胞和成纤维细胞是相似的[9]，外部培养条件不同[10]2006 54 38，22 (6)。不同的是，它们需要成脂因子的作用。目前，这类物质被称为胰岛素、糖皮质激素和糖皮质激素。异丁基？1?甲基黄嘌呤、纤连蛋白等。一般以DMEM和F12为培养基，配比为1！1比例，细胞数量适中，初始接种时细胞黏附不是很牢固，移动要轻柔，避免细胞漂浮。所选材料越年轻，越容易生长。人类一般选择外科手术切割腹部脂肪组织，如果用注射器吸，容易损伤细胞，降低存活率。(本文图1，2见插图2)参考文献:[1] Haunerh，Petruschketh，Russm等.肿瘤坏死因子α(TNF？)onglucosetransportandlipidmetabolismofnewly？differentedhumanfatcellincellculere[J].糖尿病，1995，38(7):764。[2]拉米雷斯？卡斯特罗的ZacariasJL？穆诺兹列多夫，库里？Har？cuchW。定量ofadiposeconversionandtriglyc？[1]李，李，等.组织化学，1992，97 (6): 493。[3]赵？帮派，刘建中。医学细胞生物学实验与练习[M]。北京:科学出版社，1999.35。[4]杜乃法。insulinationinthepolysicovalysyn？drome[J]。内分泌激素和内分泌激素。MetabClinNorAm，1999，28(2):341。[5]梅杰·比林斯。Historicalreviewandpresentsta？tusoffreefatgraftautotransplantationinplastic Andre？建筑外科学[J].PlastReconstrSurg，1989，83(2):368。[6]范尔勒，贝利斯塞，龙卡里达克。成人脐血前体细胞培养的细胞学和酶学特征[J].JCLININvest，1976，58 (9): 699。[7]朱小海，何青莲，林子豪。人前脂肪细胞培养、增殖和分化模型的建立[J].中国整形烧伤外科杂志，1999，15 (3): 199。[8]卡拉罗，李，约翰逊。易易工作室-各种在线工具，站长网志，以及多个应用项目。Celtissres，1991，264 (2): 243。[9]刘？清·邓·。内皮-平滑肌共培养:细胞间相互作用对组织纤溶酶原激活剂的影响[J].中山医科大学学报，1992，13 (4): 18。[10]朱永元，李天增，苏爱云，)