流式细胞仪的原理是什么？
在流式细胞仪测量中，常用两种散射方向:①前向角(即零度角)散射(FSC)；②侧向散射(SSC)，又称90°角散射。此时，角度是指激光束的照射方向和用于收集散射光信号的光电倍增管的轴向之间大致形成的角度。一般来说，前向散射光的强度与细胞的大小有关，对于同一细胞群体，它随细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞的实验表明，在很小的立体角范围内，球形活细胞与横截面积之间存在线性关系。对于形状和朝向复杂的细胞，可能会有很大的差异，需要特别注意。横向散射光的测量主要用于获得关于细胞中精细结构的粒子特性的信息。虽然侧向散射光也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、细胞质和核膜的折射率更敏感，对细胞质中较大的颗粒也能给出灵敏的反应。
在实际使用中，仪器首先要测量光散射信号。当光散射分析与荧光探针结合时，可以区分染色和未染色的细胞样品。光散射测量最有效的用途是从异质人群中识别某些亚组。
荧光信号主要包括两部分:①自发荧光，即无荧光的染色细胞内部的荧光分子在光照后发出的荧光；(2)特征荧光，即荧光染料在光照下染色后与细胞结合发出的荧光，其荧光强度较弱，波长与照射激光不同。自体荧光信号是一种噪声信号，在大多数情况下会干扰特定荧光信号的分辨率和测量。在免疫细胞化学等测量中，如何提高信噪比是低结合水平荧光抗体的关键。一般来说，细胞成分中能产生自发荧光的分子(如核黄素、细胞色素)含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞与活细胞的比例越高，自发荧光越强；细胞样品中亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰，提高信噪比的主要措施有:①尽量使用较亮的荧光染料；(2)选择合适的激光器和滤波光学系统；③电子补偿电路用于补偿自发荧光的背景贡献。
样本分选原理流式细胞仪的分选功能是由细胞分选仪完成的。整体过程如下:从喷嘴喷出的液柱被分成一系列小水滴，由逻辑电路根据一个选定的参数判断是否会被分选，然后由充电电路对选定的细胞液滴进行充电，充电后的液滴携带细胞通过静电场偏转，落入收集器中；其他液体作为废液被抽出，一些类型的仪器也使用收集管进行分类。
在几十KHz的电信号作用下，流动腔上的压电晶体振动形成稳定的液滴，迫使液流均匀破碎。一般液滴间距在几百μ m左右，实验经验公式f=v/4.5d给出了形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液体流速，d是喷嘴直径。可以看出，通过使用不同直径的喷孔和改变液体流速，可以改变分离效果。包含细胞的分离液滴在静电场中的偏转由充电电路和偏转板完成。充电电压一般为+150V或-150V；偏转板之间的电位差是几千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，所以从参数确定到逻辑选择后脉冲充电需要一个延迟时间，一般是几十ms。延迟时间的准确确定是决定排序质量的关键，移位寄存器数字电路常用来产生延迟。可根据具体要求适当调整。
(50)数据处理原理:FCM的数据处理主要包括数据显示和分析，如何解读仪器给出的结果取决于要解决的具体问题。
①数据显示:FCM的数据显示方式有单参数直方图、二维点状图、二维等高线图、伪三维图、列表方式。
直方图是一维数据最常用的图形显示形式，既可以定性分析，也可以定量分析，就像一般X-Y平面绘图仪给出的曲线一样。根据所选放大器的类型，坐标可以是线性标度或对数标度，用“轨迹数”表示，本质上是测量的荧光或散射光强度。坐标通常表示细胞的相对数量。图10-2显示了直方图形式。它的局限性是只能显示一个参数和细胞之间的关系。
二维点图可以显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。坐标和坐标是与细胞相关的两个独立的参数，平面上的每一个点都同时用相应的坐标值表示细胞的存在。二维点图可以得到两个一维直方图，但是由于合并现象，二维点图的信息量大于两个一维直方图的信息量。所谓合并，就是多个单元二维坐标相同，在地图上只显示一个点，在单元点密集的地方很难显示其精细结构。
二维点状地图二维等高线地图类似于等高线在地图上的表示。它是克服二维点阵图缺点的一种显示方法。等高线图上每一条连续的曲线都有相同的相对或绝对单元数，即“等高线”曲线层次越高，代表的单元越多。一般等级所代表的细胞数的区间是相等的，所以等高线越密，变化率越大，等高线越细，变化越平衡。图10-4显示了二维等高线图的模式。
伪三维地图是利用计算机技术对二维等高线图进行直观、形象的表示方法。它同时显示了原始二维图中的隐藏坐标——细胞数，但参数维图可以旋转倾斜，从多个方向观察“峰”和“谷”的结构和细节，这无疑有助于分析数据。
伪三维图表列表模式实际上只是多参数数据文件的一种计算机存储模式，利用多个直方图、二维图表和伪三维图表完成三个以上参数数据的显示。ListMode中的特殊技术可用于打开一个窗口或使用光标调出相关部分，然后更改尺寸以显示它。比如“一调二调”就是在一维图上调出二维图；“二调一调”就是从二维图调出一维图。图10-6是从二维地图的等高线图中调出对应窗口的直方图示意图。
图10-6从二维图形中绘制直方图。以上简单介绍了几种数据展示形式。在实际应用中，可以根据自己的需求选择匹配，以便了解和获取尽可能多的有用信息。
②数据分析:数据分析方法一般可分为参数方法和非参数方法。当待测生物系统可以使用某种数学模型技术时，通常使用参数化方法。数学模型可以是一个方程，也可以是一组方程，生成方程参数所需的信息来自测量数据。例如，在测定小鼠精子的DNA含量时，可以获得细胞频率的尖锐波形分布。如果用正态分布函数来描述这些数据，参数就是面积、平均值、标准差。最小二乘法通常用于拟合方程的数据。非参数分析方法不需要对测量的分布形状做任何假设，即采用非参数分析方法。分析程序可以很简单，只需要直观地观察频率分布；也可能比较复杂，两个或两个以上的直方图要一一比较。
逐点描迹(无论是手工描迹，还是描迹仪或计算机系统描迹)是大家常用的一种重要的数据分析手段。我们经常可以用它来了解数据的特征，发现那些意想不到的特殊症状，选择统计分析模型，显示最终结果。事实上，在没有首先直观地观察和分析数据的情况下，千万不要对这批数据进行数值分析。从这个角度来看，非参数分析是参数分析的基础。
比较每个通道需要做大量的工作，但是通过直观的方法很容易发现明显的差异，特别是在对照组和试验组。考虑到FCM的可靠性，需要注意的是每一组都要有一个对照组，可以是空白对照组、阴性对照组，也可以是零时间对照组等。具体设置要根据整体实验要求来确定。对照组和测试组之间的比较往往可以减少许多不必要的错误和误解。顺便说一句，将曲线的总细胞数归一化，甚至将两条曲线逐一相减，得到“差异结果曲线”往往是合适的。
因为数据分析往往与结果的解读密切相关，也就是说与生物背景有关，所以具体的分析方法和原理后面会举例介绍。