动物细胞大规模培养的方法有哪些

根据动物细胞的类型，可采用单层培养、悬浮培养和固定化培养进行大规模培养。

一、动物细胞的生长特性和培养温度

1，细胞生长缓慢，容易被污染，培养需要抗生素。

2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差。

3.它需要较少的氧气，不能忍受强烈的通风和搅拌。

4.人口增长效应，附着增长(锚定依赖)

5.培养过程中的产物分布在细胞内外，成本较高。

6.原代培养的细胞通常在50代后退化和死亡。

根据体外培养中对生长底物依赖性不同，动物细胞可分为两种类型:

依赖粘附的细胞:它们需要附着在带有适当电荷的固体或半固体表面上才能生长。大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多非整倍体细胞，都属于这一类。

不依赖粘附的细胞:它们可以不粘附于固体表面而生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞和一些转化细胞。

培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织的正常温度。人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35~37℃。偏离这个温度，细胞的正常代谢和生长就会受到影响，甚至死亡。一般来说，培养的细胞对低温的耐受力高于对高温的耐受力。当温度不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞在39~40℃培养65438±0h，有一定程度的损伤，但仍能恢复。当温度达到43℃以上时，许多细胞就会死亡。当温度降至30~20℃时，细胞代谢下降，因此与培养基的物质交换减少。首先看到的是细胞的形态变化和细胞从基质中脱落。当培养物回到初始培养温度时，它们的原始形态和代谢也回到原始水平。

第二，单层培养(附着培养)

它是指细胞附着在某一固体表面上的培养。

1.生长特性:培养时贴壁细胞应附着在培养容器(瓶)壁上。细胞一旦贴壁，就会迅速扩散，然后开始有丝分裂，迅速进入对数生长期。一般几天后，培养面被覆盖，形成致密的细胞单层。

2.单层培养的优点:

容易更换培养液；细胞紧密附着在固相表面，旧培养液可直接倒掉，新培养液清洗后可直接加入。

灌注培养易于采用，从而达到提高细胞密度的目的；因为细胞固定了表面，所以不需要过滤系统。

当细胞粘附于生长基质时，许多细胞将更有效地表达一种产物。

相同的设备可以使用不同的培养基/细胞比率。

适用于所有类型的细胞。

3.单层培养的缺点:与悬浮培养法相比，

拓展训练难度大，投入大；

占地面积大；

不能有效地监控细胞的生长；

4.细胞粘附表面:需要净正电荷和高表面活性。对于微载体，也需要一定的电荷密度；如果是有机表面，一定是亲水的，带正电荷的。

5.单层培养系统:主要包括转瓶、中空纤维(后面介绍)、玻璃珠和微载体系统(后面介绍)。

摇瓶培养系统:首先用摇瓶系统培养贴壁依赖细胞。转瓶培养一般用于从小规模培养到大规模培养的过渡阶段，或者作为一种为生物反应器接种准备细胞的方式。将细胞接种在旋转的圆柱形培养箱-旋转烧瓶中，培养过程中旋转烧瓶不断旋转，使细胞与培养液和空气交替接触，从而提供更好的传质和传热条件。

转瓶培养具有结构简单、投资少、技术成熟、重复性好、简单增加转瓶数量进行扩增等优点。但是，它也有其缺点:劳动强度高，占用空间大，单位体积用于细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养过程中对环境条件的监测和控制有限。目前转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两种。

反应器单层培养在这种培养模式下，细胞生长在固定的表面上，不会因为搅拌而随培养液流动，因此更容易更换培养液，不需要专门的设备将细胞从培养液中分离出来，可以采用灌注培养获得高细胞密度，可以有效地获得产物；但难以扩大规模，不能直接监测细胞的生长情况，因此多用于制备剂量小、价值高的生物药物。

CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的单层培养生物反应器，可用于细胞单层培养，具有篮式搅拌系统和盘形载体。这种载体是直径为6 mm的非织造聚酯纤维盘，具有高的表面积/体积比(1200cm2/g)，有利于获得高的细胞密度。篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养最常用的方法，用于杂交瘤细胞、Hela细胞、293细胞、CHO细胞等细胞。这样培养的细胞，接种后可以很快贴壁。

三、悬浮培养(suspension culture)

指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于无贴壁依赖性的细胞培养，如杂交瘤细胞；它是在微生物发酵的基础上发展起来的。

无血清悬浮培养是一种用已知的人或动物来源的蛋白质或激素代替动物血清的细胞培养方法。可以减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为大规模动物细胞培养的一个新的研究方向。

四。固定化培养。

动物细胞与水不溶性载体结合，然后培养。这两类细胞均适用，具有细胞生长密度高、抗剪切能力强、抗污染能力强的优点，且细胞易于分离产物，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、价态附着法、离子/价态交联法、包埋法、微胶囊法等。

1.吸附法:用固体吸附剂将细胞吸附在其表面来固定细胞的方法称为贴壁法。操作简单，条件温和，是最早用于动物细胞固定化的方法。缺点是:载体负载量低，电池容易脱落。微载体培养和中空纤维培养是这种方法的代表，后面会介绍。

2.* * *价附着法:动物细胞通过* * *价键与固体载体结合的固定化方法称为* * *价共价键附着法。这种方法可以减少细胞的渗漏，但是引入了化学试剂，影响了细胞的活性，而且因为粘连扩散限制小，细胞没有得到保护。

3.离子/* * *价交联法:细胞悬液用双功能试剂处理时，细胞间会形成桥，絮凝产生交联作用。这种固定细胞的方法称为离子/* * *价交联。交联剂会造成部分细胞死亡，也会造成扩散限制。

4.包埋法:将细胞包埋在多孔载体中制成固定化细胞的方法称为包埋法。优点是步骤简单，条件温和，负荷大，细胞渗漏少，抗机械剪切。缺点是:扩散限制，不是所有细胞都处于最佳基质浓度，大分子基质无法渗透到聚合物网络中。一般来说，它适用于非附着依赖细胞的固定化。常用的载体是多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和纤维蛋白。

5.微囊化:用亲水性半透膜将细胞包裹在珠状微囊中，使细胞无法逃逸，但小分子和营养物质可以自由进出半透膜；胶囊是一个微小的培养环境，类似于液体培养，可以保护细胞不受损伤，所以细胞生长良好，密度高。微胶囊的直径应控制在200-400 μ m，制备时应注意:

温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；

所用试剂和膜材料对细胞无毒；

膜的孔径可以控制，营养物质和代谢产物必须自由通过；

膜应该具有足够机械强度以抵抗培养过程中的搅动。