细胞培养的具体步骤、要求和注意事项
冷冻细胞从液氮中取出后，在37℃的水浴中不断摇动以促进其融化。转移至15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，2000 rpm离心2 min，弃去上清液。
加入10ml DMEM培养基清洗，弃去上清液。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹，接种于10cm平板中，于含5%CO2的细胞培养箱中培养。
第二，细胞传代
当细胞密度达到80%~90%时，除去培养基，用10ml PBS洗涤两次。加入含0.25%EDTA的3ml胰蛋白酶3min，置于细胞培养箱中3分钟。加入1毫升DMEM完全培养基以终止胰酶消化，并转移至15毫升离心管中。
加入10ml PBS清洗细胞培养板，转移至15ml离心管，2000 rpm 2min，弃去上清液。加入10ml PBS(高压灭菌，40℃保存)，吹匀，吸取10微升计数，按1×106个/板接种，在含5%CO2的细胞培养箱中继续培养。
第三，细胞冷冻保存
当细胞密度达到80% ~ 90%时，除去培养基，用10ml PBS洗涤两次。加入含0.25%EDTA的3ml胰蛋白酶3min，置于细胞培养箱中3分钟。加入完全培养基lmlDMEM以终止胰酶消化，并转移至15ml离心管中。加入10ml PBS清洗细胞培养板，转移至15ml离心管，2000 rpm 2min，弃去上清液。
加入lml冷冻液(90%血清，10%DMSO)，放入冷冻箱(箱内有异丙醇，保证降温速度)，立即放入80℃冰箱，过夜，第二天放入液氮中，可保存至少两年，如果液氮不释放，可保存三个月。
冻存液的制备:应缓慢加入70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO，同时摇动。
需要注意的事项
(1)进入细胞间隙开始细胞培养时，必须严格遵循以下步骤:
①确保用于细胞操作的所有溶液和消耗品都已经消毒和测试，没有问题。不使用不确定的解决方案和耗材，不借用别人的解决方案，除非有特殊情况。
(2)确保衣服的袖口已经卷起来或者白大褂的袖口已经系好。
③确定酒精灯中的酒精量，必要时及时补充。
(4)确保所有需要的溶液和消耗品都在手边。为了用一只手打开瓶盖，在实验开始之前，所有的瓶盖都可以拧开。
⑤除非瓶口没有烧焦，否则尽量不要直接倒溶液。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷有75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围(不要接触瓶口)，然后简单地在火焰上燃烧。
6.如果在操作过程中不确定使用的耗材是否干净，一定要及时更换。
⑦实验结束后及时清理，保持工作区域干净整洁，最后用75%的酒精清洗桌子。
(2)防止细胞污染
(1)实验用品防止污染。细胞培养所用的试剂、耗材、设备要彻底清洗消毒，各种溶液要仔细灭菌，无菌试验阴性后才能使用。手术室和剩余无菌设备应定期清洗、消毒和灭菌。
(2)操作过程防止污染。
③易产生静电或吸附灰尘的衣服，进牢房前一定要换上白大褂。
(4)实验前，要确定戴的手套没有问题。手套只要接触到生物安全柜外的物品，就必须及时消毒。
⑤进入细胞培养室后关好门，尽量少坐少走，以免影响生物安全柜的空气幕。开始工作前，用75%酒精棉球擦拭双手和瓶盖。事先严格检查使用的设备、溶液和细胞，不要将污染或未消毒的物品带入无菌室，更不要随便使用，以免造成大规模污染。
⑥细胞操作要轻，瓶口必须在火焰周围的无菌区打开，瓶口要简单旋转，在火焰周围烧灼。小心不要让火焰熔化塑料瓶口。
⑦实验操作过程中，生物安全柜的隔板应尽可能降低，尽量减少交谈。打喷嚏或咳嗽时千万不要指向工作区域，以免造成不必要的污染。
⑧瓶盖要放在远离自己的地方，以免被误操作污染。
⑨不要从敞开的容器口上方通过，以免不明物体从衣服上掉落污染细胞。
⑩实验操作时应注意及时更换巴斯德移液管、移液管枪尖和移液管，决不能一管到底。一旦发现不干净或不能确定干净的物品，必须直接丢弃。实验结束后要及时清理，保持实验室干净整洁，最后用75%的酒精清洗桌子。
(3)防止细胞交叉污染
①进行各种细胞培养操作时，所用的仪器应严格区分，最好做好标记，便于识别。按顺序进行操作时，一次只处理一个细胞，多个细胞、多个操作一起进行，容易出现T-混沌。
(2)在液体交换或通过操作时，移液器头和装有细胞的移液器不要接触试剂瓶的瓶口，以免将细胞带入培养基，污染其他细胞。
(3)所有细胞一旦购买、从外地引进或自行建立，必须及时保存和冷冻，一旦污染，可以复苏培养。
扩展数据:
细胞培养是在体外模拟体内环境(无菌、适宜的温度、酸碱度和一定的营养条件)，使其能够存活、生长、繁殖并维持其主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，生物学上的正式术语是细胞培养技术。
无论对于整个生物工程技术还是生物克隆技术之一，细胞培养都是必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以将一个细胞经过大量培养后转化为简单的单细胞或分化很少的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，细胞培养本身就是细胞克隆。
细胞培养技术是细胞生物学研究方法中一项重要且常用的技术。通过细胞培养，可以获得大量细胞，研究细胞信号转导、细胞合成代谢、细胞生长和增殖。
参考资料:
百度百科:细胞培养