微生物生长曲线的检测方法
体积测量法:又称菌丝体浓度测量法。
通过测量一定体积培养基中所含菌丝的数量，可以反映微生物的生长状况。方法是取一定量的待测培养液(如10 ml)置于带刻度的离心管中，设定一定的离心时间(如5分钟)和转速(如5000 rpm)，离心后倒出上清液，测得上清液体积为V，菌丝体浓度为(10-V)/65438。菌丝体浓度的测定是大规模工业发酵生产中微生物生长的重要监控指标。这种方法广泛、简单、快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差会很大，因为离心沉淀中混有一些固体营养物，结果会有些偏差。
称重干重法:
它可以通过离心或过滤来确定。一般干重是10-湿重的20%。离心法是将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，离心，用清水离心洗涤1-5次，干燥。干燥可在105℃或100℃的烘箱中进行，或通过红外线，或通过80℃或40℃的真空干燥，然后称重。如果用过滤法，丝状真菌可以用滤纸过滤，细菌可以用醋酸纤维素膜等滤膜过滤，过滤后用少量水冲洗，40℃真空干燥，叫干繁殖法比较复杂。通常，当获得的微生物产物为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母、ADY)、一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
浊度法:
微生物的生长导致培养物浊度增加。用紫外分光光度计测量某一波长的光吸收值来判断微生物的生长情况。一个带有侧臂的特殊三角瓶可以用来定期跟踪培养物中细菌的生长。将侧臂插入光电比色计比色座的孔中，无需取菌液即可随时测定其生长情况。这种方法主要用于监控发酵工业中细菌的生长。比如我用的是UNICO公司的紫外可见分光光度计，用比色管在波长600nm处定时测量发酵液的吸光度值OD600，来监测大肠杆菌的生长和诱导时间。
菌丝体长度的测量:
对于丝状真菌和一些放线菌，我们可以在培养基上测量一定时间内菌丝生长的长度，或者用一端开口、带有刻度的细玻璃管，进入合适的培养基，躺下，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录菌丝生长的长度，从而测量丝状微生物的生长情况。
微生物计数法
血细胞计数平板法:
血细胞计数板是一种具有特殊结构尺度和厚度的厚玻璃板。载玻片上有四个凹槽和两个脊，中央有一个短的水平凹槽和两个平台。两个脊的表面比两个平台的表面高0.1 mm。每个平台上刻有不同规格的网格，中心0.1 mm的区域上刻有400个小方块。用油镜观察，统计某个大细胞中的微生物数量，就可以计算出1 ml菌液中所含的细菌数量。这种方法简单、直观、快速，但只适用于对单细胞微生物或丝状微生物产生的孢子进行计数，结果是包括死细胞在内的细菌总数。
染色计数方法:
为了弥补某些微生物在油镜下不易观察计数，血细胞计数平板法无法直接区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料，在显微镜下可以更方便地计数活菌。例如，可以用亚甲蓝染色液来计数酵母活细胞的数量。染色后，活细胞无色，死细胞蓝色。
比例计数法:
将颗粒浓度已知的液体(如霉菌孢子或红细胞)和待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野内通过计数各自的数量即可得到未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较广泛。并且有必要制备具有已知颗粒浓度的悬浮液作为标准。
液体稀释法:
未知细菌样本被连续稀释10倍。根据估算，从最合适的10倍连续三次稀释中取5 ml样本，接种于含***15培养基的三组试管中。培养后，记录每个稀释度下生长的试管数，然后求出最大概率表MPN(最可能数)。这种方法常用于检测食品中的微生物，如饮用水和牛奶的微生物限度检查。
平板菌落计数法:
这是最常用的活菌计数方法之一。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积稀释后的菌液在固化前与合适的固体培养基混合均匀，或将菌液涂布在固化后的固体培养基平板上。孵育后，原始细菌溶液的细菌计数可以通过将平板上出现的菌落数乘以细菌溶液的稀释度来计算。一般直径9cm的平板上出现50-500个菌落。但方法比较麻烦，操作者需要熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得到菌液中的活菌数，而且可以一次分离培养菌液中的细菌，得到单克隆。
试纸法:
在平板计数法的基础上，开发了用于快速计数的小型商用产品。有小而厚的滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂上吸取合适的培养基，加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，无色)浸泡试验菌液，然后在密封包装袋中培养。短期培养后，滤纸上出现具有一定密度的玫瑰色小菌落，对照标准纸色板上的光谱，即可估算出样品的细菌含量。试纸计数法快速准确，避免了平板计数法的人为操作误差。
薄膜过滤法:
用特制滤膜过滤一定体积的含菌样品，用橙色染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光。活细胞会发出橙色荧光，而死细胞会发出绿色荧光。
生理指数法:
微生物的生长伴随着一系列生理指标的变化，如发酵液的pH、含氮量、含糖量、产气量等。与生长量平行的生理指标有很多，可以作为生长测量的相对值。
氮含量的测定:
大多数细菌的含氮量为12.5%干重，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，可以确定粗蛋白的含量。测定氮含量的方法有很多，如硫酸消化法、高氯酸消化法、碘酸消化法、磷酸消化法和杜马斯法测定N2气体。杜马斯测量N2气体的方法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热，产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸收CO2后测量N2的量。
碳含量的测定:
将少量生物材料(0.2-2.0 mg干重)混合到1 ml水或无机缓冲液中，用2 ml 2% K2Cr2O7溶液在100℃加热30分钟，然后冷却。加水稀释至5 ml，在580nm波长处读取吸光度值，计算生长量。需要使用试剂作为空白对照，使用标准样品作为标准曲线。
还原糖的测定:
还原糖通常指单糖或寡糖，可被微生物直接利用。还原糖的测定可以间接反映微生物的生长情况，常用于大规模工业发酵生产中微生物生长的常规监测。方法是:将发酵液离心，取上清液，加入费林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，在接近终点时加入淀粉溶液，继续加入Na2S2O3至终点，查表读出还原糖含量。
氨基氮的测定:
方法是将发酵液离心，取上清液，加入甲基红和盐酸作为指示剂，加入0.02N NaOH调节颜色至颜色刚好褪色，加入18%中性甲醛作为底物，反应几分钟，加入0.02N变色，根据NaOH的量计算氨基氮的含量。根据培养基中氨基氮的含量，可以间接反映微生物的生长状况。
其他生理物质的测定:
P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)的含量和其他指标，如产酸、产气、产CO2(以标记葡萄糖为底物)、耗氧量、粘度和产热，都可以用来确定生长。还可以根据反应前后底物浓度的变化、最终产气量和微生物活性来反映微生物的生长情况。比如BMP-2的发酵生产，我总是通过监测溶解氧和pH值的变化来判断细菌的生长情况。
商业化快速微生物检测方法；
微生物检测的发展方向是快速、准确、简便和自动化。目前，许多生物制品公司利用传统的微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计出各种类型的微生物检测仪器和设备，逐渐广泛应用于医学微生物检测和科学研究中。例如:
1、抗干扰培养基和快速微生物数量检测技术的结合，解决了传统微生物检测方法无法解决的问题，为建立完整的抗干扰微生物检测体系奠定了坚实的基础。抗干扰微生物培养基、新型生化鉴定管、微生物计数卡、环境质量检测试剂盒等。由中科院广州分院合作工业部提供，可方便地用于多种测试。
2.BACTOMETER的全自动细菌总数和快速细菌检测系统可在数小时内获得监测结果，样本的颜色和光学特性不影响读数。对酵母菌和霉菌检测同样高灵敏度的原理是通过阻抗技术将待测样品和培养基放入反应试剂盒中，底部有一对不锈钢电极，测量微生物生长引起的阻抗变化。例如，当微生物生长时，培养基中的大量营养物质可以通过代谢转化为活性小分子，这种微弱的变化可以用电阻抗法检测，这样就可以比传统的平板法更快地监测微生物的存在和数量。测定项目包括细菌总数、酵母菌、大肠杆菌、霉菌、乳酸菌、嗜热菌、革兰氏阴性菌、金黄色葡萄球菌等。