药用植物离体培养的再生植株有哪些？
一、植物再生的意义植物生物技术以植物组织培养为主要手段，包括五个分支，即利用离体技术改良植物品种、经济植物快速繁殖、种质超低温保存、植物细胞大量培养和植物基因工程。药用植物的离体培养，除了大量的植物细胞外，其余都涉及到再生植株的培养。与普通植物不同，在培养药用植物再生植株时，需要注意药用成分的变化。
(1)快速繁殖
通过离体大量培养再生植株达到快速繁殖的目的，主要用于:(1)自然繁殖率低的植株；(2)性状不一致的杂合植物，(3)资源稀缺的濒危植物；(4)新培育的优良品种；(5)发芽优良品种和性状优良的首选单株；(6)少量从国外引进的植物材料；(7)育种过程中需要快速扩繁的一些自交系、原始材料和杂交后代；(8)通过组织培养或自然条件获得的三倍体和多倍体植物；(9)清除致病菌(真菌、细菌和病毒)的植物。快繁技术能否应用取决于:(1)培养技术简单、稳定、完善；(2)成本低于常规方法；(3)具备一定的设备条件和技术实力；(4)市场需要且价格合适。如罗汉果、金钗石斛。
(2)无病毒植物
通过茎尖培养，或通过花瓣培养和愈伤组织长期培养，可获得去除主要病毒的无病毒植株，将其作为母本进行大田生产，可获得大量无病毒苗，可提高产量和品质，防止品种退化。如地黄、菊花等。
(3)种质保存
在4℃的低温或液氮中，植物组织和细胞的生活力可以维持很长时间。可用于超低温保存的植物材料有:(1)茎尖和侧分生组织；(2)培养的植物细胞和胚状体；(3)原生质体；(4)植物器官，如胚、胚乳、子房、花药、花粉和种子。冷冻植物材料可以节省人力、土壤和物力。便于区域和国际种质交流，通过离体繁殖提供育种原料和脱毒苗。
(4)品种改良
利用离体技术改良植物品种的方法主要有:(1)通过培养花药、花粉、未受精子房和胚珠获得单倍体植株，进行单倍体育种；(2)通过胚乳培养获得三倍体植株，或在植物组织培养中通过秋水仙碱或其他因子获得多倍体植株；(3)通过体细胞克隆变异和细胞突变体筛选，获得性状优良的变异体和突变体；(4)原生质体培养和细胞杂交。无论采用什么育种技术，都需要对植株进行诱导再生，并对其后代进行鉴定。如人参、枸杞等。
(5)植物基因工程
植物基因工程包括基因分离、载体系统和受体系统。它直接以控制性状遗传的基因为操作对象，可以更准确地改良品种。目前，已经分离和克隆了20多种基因。载体系统主要研究铜绿假单胞菌的Ti质粒系统(农杆菌T-DNA)。作为受体系统，可以使用原生质体、悬浮培养的细胞、来自愈伤组织或完整植物的体外植物器官。无论使用何种受体系统，转化细胞都必须再生为完整的植株，而植株再生是植物基因工程中的一个主要环节。如龙葵和菘蓝。
二、植物再生的基本原理
生物界普遍存在再生现象，生物再生是自然选择和人工选择的结果。一般低等生物再生能力强，神经系统更发达的高等动物再生能力较弱。在植物中，细胞、组织和器官可以在体外生长发育，形成完整的植物。然而，不同种类的植物，或同一植物的不同品种，甚至同一植物的不同组织和器官的细胞具有不同的再生能力。一般野生植物比栽培植物再生能力强，无性植物比种子繁殖植物强。
植物再生的基础在于细胞的遗传全能性，即每个细胞都包含了产生一个完整生物体的全部遗传信息。在适当的条件下，一个具有全能性的活细胞的发育和分化受其DNA上某些基因的激活或抑制控制，一个细胞可以形成一个全新的生物体。植物离体再生是细胞离体培养在各种环境因素的刺激和作用下，脱分化和再分化的结果。可能是因为植物细胞的分化只是相对稳定的。在离体培养中，特化细胞更容易通过去分化恢复全能性，全能性去分化细胞再分化产生完整的小植株。分化是植物再生的中心问题，它与许多因素有关。植物激素是化学信使。作为基因表达的“效应器”，它们对RNA和蛋白质的合成有直接影响，并在细胞去分化和再分化过程中发挥重要的有时是决定性的作用。
虽然很多问题还很不清楚，但目前认为植物再生的基本原理是:(1)植物细胞的全能性；(2)植物细胞的脱分化和再分化；(3)植物激素的平衡。这些基本原则既是组织培养的一般指导原则，也是有待进一步研究的一些基本理论课题。
三、植物再生的基本途径
离体培养再生植株的形态发生有两种基本方式，即器官发生和胚胎发生。
这两种形态发生中的一些经历愈伤组织阶段，而另一些则直接在离体的母体组织中产生。
器官发生
器官发生的方式是通过器官分化形成完整的植株，如贝母、藏红花、白子菜、芦荟等。离体培养的器官分化包括不定芽、不定根、鳞茎、球茎、块茎、原球茎和花的形成。不定芽和不定根形成再生植株的途径有三种:(1)先形成芽，然后在芽上产生根；(2)先形成根，然后在根上产生芽；(3)愈伤组织上同时产生芽和根，然后在芽和根之间形成维管系统，连接成统一的轴状结构。大多数情况下，是第一种方式。还有通过鳞茎、球茎、块茎、原球茎等器官分化的不同情况。
在植物组织培养中，虽然通过器官发生进行植物再生的报道很多，但是关于基础研究的信息还是很少。大多数研究继续集中于外植体、培养基和环境条件调节的经验操作。大多数情况下，人们只能观察到已经表现出来的分化状态，而很难追踪到分化的过程。与形态发生的起源和方向相关的因素目前还不清楚。在这些因素中，有离体培养体系中各种物质的变化和相互作用，这些物质来源于培养过程中的培养基、外植体及其代谢产物。
体外培养，只有少数细胞被激活，而且启动是异步的。Torrey(1966)提出了分生组织假说，形态发生始于愈伤组织中形成的分生组织团，即分生组织。在培养体系中各种因素的作用下，分生组织产生不同的原基，这些原基或形成根、芽，或因因素的不同性质而发育成胚状体。分生组织可能发生在组织和培养基的界面上，其形成部位可能由从培养基向组织扩散的物质引起的生理梯度决定。
Skoog和Miller提出了激素平衡假说，认为器官分化与细胞分裂素和生长素的比例有关。在大多数情况下，生长素与细胞分裂素的高比例有利于根的形成，反之则有利于芽的形成。由于内源激素的存在和外植体抑制物质的积累，出现了许多相反的情况。在这一原理的实际应用中，有时需要添加或省略某种植物激素，要考虑以下因素:(1)植物激素的种类和组合；(2)植物激素的绝对浓度；(3)植物激素，主要是细胞分裂素与生长素的比例；(4)植物激素的顺序效应；(5)其他因素，如外植体、营养条件、碳源种类和浓度等理化因素。
(2)胚胎发生
胚胎发生植株再生是先形成胚状体，然后通过胚状体萌发形成完整的植株。胚胎发生是高等植物中的普遍现象，据观察，属于40多个科的150多种植物具有胚胎发生能力。关于胚状体的概念，朱坤提出(1978)胚状体是起源于植物组织培养中的非合子细胞，通过胚胎发生和胚胎发育形成的胚状结构。这个定义包括以下含义:(1)胚状体是组织培养的产物，仅限于在组织培养中使用，不同于无融合生殖胚；(2)胚状体起源于非合子细胞，不同于合子胚；(3)胚状体的形成经历了胚胎发育的过程，不同于组织培养中的分化芽。
胚状体的来源可分为五类:(1)组织和器官；(2)愈伤组织；(3)游离单细胞；(4)小孢子；(5)原生质体。有些起源于单细胞，有些起源于多细胞。胚状体的形成有两种方式(Sharp et al，1980): (1)直接:胚状体的形成直接来源于一个预先确定的胚胎细胞体外培养组织，无愈伤组织；(2)间接发生:胚胎发生通过愈伤组织，由愈伤组织发育成诱导胚胎决定细胞。在培养体系中相关因素的影响下，胚胎细胞不断分裂增殖，形成胚胎细胞团，进而发育成球形胚胎。通常，胚胎细胞体积小，细胞核大，细胞质致密，淀粉粒大。球形胚胎组织可与周围组织分离，这与合子胚胎的发育过程相似。球形胚发育并分化为心形胚、鱼雷形胚和具有子叶的成熟胚。成熟胚状体在形态上与合子胚相似，有胚根、胚和子叶。在分化培养基上，胚状体像种子一样萌发，下胚轴伸长，叶子展开，根发育并形成叶绿素，各种器官进一步生长形成小植株。胚状体的形成导致了人工种子的发展。
胚胎发生到植株形成是一个连续的过程，可分为三个连续的阶段:(1)胚状体的起源；(2)胚状体分化；(3)胚状体萌发并生长形成小植株。实践中，胚胎细胞的诱导和胚状体形成的发育过程可能在同一培养基上形成，也可能需要分别进行两次培养。当胚状体形成绿色植株时，需要转移到分化培养基上。如果培养基中的化学物质，主要是植物激素，不平衡。胚胎细胞的分化和胚状体的发育会受到抑制，出现异常的胚胎组织块。这些畸形结构也可能具有胚胎发生的潜能。
胚胎发生和植物激素的关系因植物而异，可分为几种类型:
1.特定生长素类型
胚胎发生必须有生长素，其他植物激素的存在起抑制作用。这种类型有两种情况:(1)生长素是诱导胚胎细胞所必需的，生长素，如胡萝卜，是胚状体形成和发育所需要减少或去除的；(2)胚状体的诱导和发育可以在相同的生长素培养基上进行。比如人参。
2.非特异性生长素类型
胚胎发生需要生长素，其他植物激素如细胞分裂素、赤霉素或脱落酸在一定比例下有协同作用，如大枣。
3.非生长素类型
胚胎发生不需要生长素，可以在细胞分裂素培养基上形成，如檀香。
4.非激素型
胚胎发生不需要植物激素，比如曼陀罗花培养。
胚状体通常需要减少或去除生长素才能分化出绿苗，细胞分裂素和赤霉素起主要作用，如人参和西洋参。
还原性氮化物在体细胞胚胎发生中起重要作用。还原的氮化物包括无机氮，例如NH+4；有机氮化物，如氨基酸、酰胺、水解酪蛋白等。正常情况下，还原态氮化物有利于胚状体的形成，但作用机制尚不明确，不同植物反应不同。许多研究表明，生长素和还原态氮化物的浓度比可能起重要作用。
不同的植物，不同的离体培养，再生植株的途径可能不同，有的主要是通过器官发生，比如烟草，有的容易产生胚状体，比如胡萝卜。然而，许多植物可以通过器官发生和胚胎发生再生植株，植物激素可以调节，如人参和西洋参。一般诱导芽分化需要细胞分裂素，生长素在诱导胚状体形成中起着重要作用。
离体培养，芽和胚状体是有分化的，它们的主要区别有:芽是单极的，与离体培养有维管组织联系，根和芽不是同时产生的；胚状体是两极的，即有根尖(胚根)和茎尖(胚)，与离体培养没有直接联系，所以是完整的植物胚胎形态。体细胞胚胎发生的发展导致了人工种子的发展。
第四，植物再生的限制因素
(一)植物再生的限制因素
离体培养再生植株可分为三类调控因素:外植体、培养基和环境条件。在这三个因素中，虽然都起着重要的作用，但相比较而言，植物再生成功的限制因素不是培养基，而是培养材料本身，即培养材料的细胞全能性的表达程度。
1.基因型的影响
不同植物种类之间再生能力差异很大，有些再生能力很强，如茄科、伞形科、十字花科等。有些很难再生，比如豆科植物。同一植物的不同品种具有不同的再生能力。由于遗传类型的影响，决定了植物再生的难度和应用前景。我们在对五加科药用植物人参、西洋参、三七、刺五加的胚培养进行研究时，得到了如下结果:(1)在附加BA2mg/l+NAA0.5mg/l的培养基上，人参、西洋参的胚培养能直接启动芽分化，转移到含有赤霉素的培养基上会形成不定芽，而三七、刺五加无芽分化。(2)在含有生长素的培养基上，这四种药用植物的胚培养物中都存在胚状体，但它们对生长素的种类和浓度有不同的反应。当添加2，4-D 0.5—1.0 mg/L时，胚胎发生能力为西洋参>人参>刺五加，而三七未观察到胚胎发生。在含有IAA的培养基上，高浓度的IAA促进人参种子的体细胞胚胎发生，而低浓度的IAA适合三七和刺五加。(3)在上述生长素条件下，人参和西洋参为间接胚胎发生，三七和刺五加为直接胚胎发生。
2.外植体的来源
体外培养，可用于培养的材料有很多，包括器官、组织甚至单细胞。虽然植物细胞是全能性的，但其表达可能仅限于某些特殊的细胞，这些细胞可能预先存在于外植体中，也可能在培养过程中产生。许多实验表明，培养材料的特性不仅影响再生的可能性，而且影响植物的生长速度和质量。在选择培养材料时，可以观察到分生组织容易分化，子叶基部再生强烈，成年树的叶片可能可逆性差，细胞全能性难以表达。当我们在体外研究西洋参的再生植株时，来自不同外植体的愈伤组织表现出不同程度的细胞全能性(表13—10)。
表13—10西洋参不同外植体愈伤组织细胞全能性的表达程度
3.外植体的状态
外植体的发育阶段和年龄、外植体的内源激素和生理状态(取样季节)、外植体的大小、外植体的预处理和母株的质量都影响着植株再生的成功。在选择外植体时，需要了解植物的生物学特性。
(2)外植体的类型和选择
离体培养，外植体有多种材料，可根据研究目的、再生途径和实验经验进行选择。
1.带芽外植体
包括茎头、侧芽、原球茎、鳞茎等。这些外植体成功率高，变异性小，易于保持材料的优良特性，通常用于脱毒植株的快速繁殖和培养(茎尖培养)。在培养中，为了诱导茎轴的伸长，常常在培养基中加入生长素和赤霉素；如果诱导腋芽生长产生丛生芽，培养基中往往有大量的细胞分裂素。
2.由分化组织组成的外植体
包括茎段、叶、根和其他营养器官；花茎、花瓣、花萼、花药、子房、胚珠、果实等生殖器官。这类外植体通常在培养过程中形成愈伤组织，通过器官发生和胚胎发生再生植株。器官发生再生的植物通常选择在自然条件下能产生不定芽的器官和组织，要根据不同植物的特性进行选择，如芦荟为茎段，菊花为花瓣，百合为鳞片。胚胎、幼花序和分生组织经常通过胚胎发生被用作外植体。这类外植体可用于克隆变异和突变体筛选，或用于单倍体育种，如花粉植株。
3.由遗传转化细胞组成的外植体
主要指植物基因工程中使用的冠瘿转化系统和DNA直接转化系统。
动词 （verb的缩写）再生植物的培养方法
(1)再生植株的培养步骤
1.建立无菌培养。
这一步骤包括外植体的选择、材料的表面灭菌和在培养基上的接种。能否得到无菌培养取决于植物材料的情况，尽可能使用培养室或温室中种植的健康旺盛的材料。田间材料的消毒比较困难，所以经常采用以下方法:(1)用抗生素溶液和杀菌剂对植物进行预处理；(2)用塑料袋包裹树枝；(3)收集枝条进行扦插，利用新芽；(4)对培养料进行多次灭菌。一些植物外植体在接种后和培养过程中变成褐色。可以向培养基中加入一些抗氧化剂、解毒剂或吸附剂，如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、二硫苏糖醇、生长促进剂、氯霉素、二乙基二硫代氨基甲酸酯、活性炭等。，以改善褐变情况。
2.愈伤组织培养
愈伤组织是植物组织培养中最常见的阶段。为了快速繁殖遗传一致的优良品系，使变异小于3%，需要尽可能避免愈伤组织。但在品种改良中，诱导愈伤组织是有益的。
愈伤组织通常由外植体伤口的表面细胞产生。愈伤组织的生长特性取决于植物材料、培养基和环境条件。从外植体到愈伤组织的建立，一般要经历诱导、细胞分裂和分化几个阶段。在外界条件特别是植物激素的作用下，少数细胞启动，代谢加强，进入活跃的细胞分裂，外植体细胞逆转为分生组织或脱分化为愈伤组织。愈伤组织的生长没有明显的极性，只有内外生长陡度，外围细胞分裂生长快于内部细胞。第三阶段，愈伤组织分化并产生一些次生代谢产物。愈伤组织最重要的特点是能通过器官发生或胚胎发生形成根、芽和胚状体，进而形成小植株。
老茧通常是淡黄色，白色和绿色，有些含有花青素形成的颜色。愈伤组织有疏松型和致密型。在继代培养中可以人工选择同一来源的愈伤组织，得到不同的细胞系。它们在细胞分化、颜色、生长速度、对营养和激素条件的要求以及合成特殊物质的能力方面有很大的差异。变异是愈伤组织的另一个重要特征。这些变异包括表型变异和基因型变异。基因型变异可能包括倍性改变、染色体畸变和基因序列改变。有益变异的选择可用于品种改良。
外植体形成愈伤组织与植物激素的关系如下:(1)只需要生长素；(2)只需要细胞分裂素；(3)需要生长素和细胞分裂素；(4)不需要植物激素。大多数情况下，生长素是诱导愈伤组织的主要因素。
在培养过程中，由于营养物质的逐渐耗竭，琼脂脱水逐渐变干，代谢产物积累，增加了毒性。愈伤组织培养需要转移到新鲜培养基上进行一段时间的继代培养。在固体培养基上，通常每4-6周进行一次继代培养。转移的培养物约5-10 mm，重约20-100 mg(街，1969)。如果体积太小，它可能生长缓慢或不生长，但是当筛选抗性时，培养物的体积更小。愈伤组织继代培养基和脱分化培养基的成分和激素条件可以相同，也可以不同，因植物而异。由于长期继代培养增加了内源激素的含量，需要适当调整继代培养基中激素的种类和含量。
3.克隆的建立
从体外培养建立克隆常常会遇到变异、细胞分化能力丧失、玻璃苗等问题。每种植物的离体培养都需要大量的实验来确定最佳的培养条件，并使之程序化，才能达到应用的目的。建立克隆体的方法大致可以用图13-2来表示。
图13-2克隆建立4示意图。生根的
芽和芽诱导生根的难易程度首先取决于植物的遗传类型。草本植物一般比木本植物容易。成年树产生的芽和枝比幼树更难生根。为了诱导生根，通常在生根培养基中加入适量的生长素，如萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸。有些植物可以在无激素的培养基上生根。生根培养基可与前一种培养基相同，常用浓度为1/2、1/3或1/4的高盐培养基或总盐浓度低的培养基。铁盐有利于根的形成，一般维持原有浓度。蔗糖是生根所必需的，不同的植物可能需要不同的量。
有些难以生根的植株可以尝试一些其他方法:(1)用高浓度生长素溶液预处理几个小时，然后用无菌水冲洗，接种到无激素培养基中；(2)用滤纸桥或蛭石代替琼脂作载体诱导生根；(3)在生根培养基中添加一些添加剂，如活性炭、B9、二甲基亚砜、根皮苷、间苯三酚等。(4)在试管中诱导休眠器官，如小块茎、小鳞茎和地下茎；(5)扦插嫩枝，直接扦插或水培。
移植
有些植物容易移栽，如芦荟试管苗直接移栽到土壤中成活率可达100%，而人参试管苗移栽尚无成功报道。对于许多植物来说，有必要研究它们特殊的移植技术。
(1)培育壮苗，移栽前锻炼。
(2)逐步过渡:首先是人工基质，如蛭石、沙子、珍珠岩、煤渣、芯土等。被引入土壤中。对于易感病害的植物，可以通过高温、化学灭菌或化学消毒等方法对人工基质进行灭菌。
(3)选择适宜的移栽期。许多木本植物和一些草本植物在根原基突出或形成几毫米的短根时成活率最高。有些草本植物可以通过二次生根诱导，第一次生根老化后再诱导新根移栽。
(4)控制移栽的环境条件，保持高湿度和良好的通风，避免阳光直射和温度波动过大。有些植物需要模拟它们的生态环境。
(5)及时防控疾病。常见的病害是猝倒病，可以用多菌灵等农药定期喷苗、喷基质。
(6)嫁接试管苗。
(2)培养基和环境条件
1.中等
根据培养材料和目的，植物组织培养可分为许多类型，如器官培养、茎尖培养、花药和花粉培养、子房和胚珠培养、胚培养、胚乳培养、果实培养、细胞悬浮培养、分生组织培养、愈伤组织培养、原生质体培养和细胞融合。不同的植物和不同种类的组织培养需要不同的培养基。目前，可用于植物组织培养的培养基约有250种。对于一般的离体繁殖，为了降低生产成本，有的采用简化培养基，用食用糖代替试剂和蔗糖，用普通水代替蒸馏水配制培养基。静态浅层液体培养比琼脂固体培养可降低成本70-80%，已用于一些植物的快速繁殖。
2.环境条件
包括培养基的pH值、培养温度、光照条件和通风条件。
一般植物组织生长的最适pH在5-6.5之间，固体培养基通常为pH5.8，液体培养基通常为pH5.0。
培养温度一般在20-28℃左右。高温(27℃左右)适合热带品种，低温(20℃左右)有利于高山植物的离体培养。鳞茎、块茎等休眠器官在试管中形成时，其萌发往往需要低温处理。
愈伤组织培养一般可以在黑暗中进行。光自养的离体培养、器官发育和植物形成都需要光。光照强度范围为300-1000—3000lx，一般为1000-3000lx。一般培养室可以设计用自然光代替日光灯。有研究表明，不同波长的色光对愈伤组织形成和器官分化有一定的影响，并且因植物种类和器官而异。光照时间取决于植物特性和实验目的，可以是连续光照或周期性光照10-16小时。块茎和其他贮藏器官的形成可能需要一个漫长的黑暗期。在研究花器官发生时，需要根据植物特性控制光照时间。
通常，在固体培养基中不能考虑空气成分，尽管在培养过程中会产生乙烯。液体培养需要注意通风。细胞悬浮培养一般采用振荡法通气。在器官分化中，可以用旋转床使组织在液体培养基中间隔生长。小体积静态浅液培养需要缩短培养时间，每四周传代一次。为了保存繁殖材料，仍应使用固体培养。
不及物动词中国药用植物离体再生研究概况
在药用植物的栽培和生产中，很多珍贵的药用植物生长周期很长，采用常规育种需要很长时间，如人参、黄连等。一些药用植物，如贝母、藏红花等。繁殖系数小，种子消耗量大。有的被病毒降解，影响产量和质量，如地黄、太子参等。一些昂贵的野生药用植物资源少，生长缓慢，如黑蓼、霍山石斛等。一些进口的南方药材，如乳香、龙血竭等，都受到苗荒的影响。为了应用植物生物技术进行药用植物的品种改良、快速繁殖、种质保存和基因工程研究，药用植物离体再生的研究和应用日益受到人们的关注。
目前离体药用植物有100多种，如爵床科九狮。猕猴桃科，猕猴属。物种毛猕猴桃变种。hispide，夹竹桃科长春花，夹竹桃，萝芙木，刺五加，人参，竹节参，西洋参，西洋参，三七，三七，印度海鞘。