培养基的目的是什么?
根据所用原料的不同,可分为两类:用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的天然培养基;用化学药品配制并标明成分的培养基称为合成培养基或综合培养基。化学试剂中的介质大部分是合成介质。因为液体介质不容易长时间保存,所以现在转化成了粉末。由于原料不同,培养基的贮存要求也不同,贮存和保存也略有不同。一般培养基受热吸潮后容易被细菌污染或分解,必须保存在防潮、避光、阴凉的地方。其中一些需要严格消毒。
常见的媒体有:
1,细菌培养基
配方1牛肉膏琼脂培养基
牛肉酱0.3g,蛋白胨1.0g,氯化钠0.5g,琼脂1.5g,
水100毫升
在烧杯中加入100 ml水,加入牛肉酱、蛋白胨和氯化钠,用蜡笔在烧杯上做标记,在火上加热。待烧杯中的成分全部溶解后,加入琼脂,不断搅拌,以免粘底。当琼脂完全溶解后,弥补水分损失,用10%盐酸或10%氢氧化钠调节pH值至7.2 ~ 7.2。
配方II马铃薯培养基
取250g新鲜牛心(不含脂肪和血管),用刀细细剁成肉末,加入500ml蒸馏水和5g蛋白胨,在烧杯上做好标记,煮沸,小火炖2h。过滤,将过滤后的肉末干燥,将滤液的pH值调至7.5左右。在每个试管中加入10ml肉汤和少量牛心碎,灭菌备用。
配制根瘤菌培养基
葡萄糖10g磷酸氢二钾0.5g
3克碳酸钙和0.2克硫酸镁。
酵母粉0.4g,琼脂20g。
水1000ml 1%结晶紫溶液1ml。
先将琼脂加水煮沸溶解,再加入其他成分,搅拌溶解,包装灭菌备用。
2.放线菌培养基
配方1淀粉琼脂培养基(高斯培养基)
可溶性淀粉2g,硝酸钾0.1g。
0.05克磷酸氢二钾和0.05克氯化钠。
0.05克硫酸镁和0.001克硫酸亚铁。
琼脂2g水100ml。
先将淀粉放入烧杯中,用5毫升水调成糊状,然后倒入95毫升水,搅拌均匀,再加入其他药物使其溶解。在烧杯外侧做好标记,加热至沸腾时加入琼脂,不断搅拌直至琼脂完全溶解,以弥补水分的损失。调节pH值至7.2 ~ 7.4,分装灭菌备用。
配方II面粉琼脂培养基
面粉60g,琼脂20g。
水1000毫升
用水调成面糊,加水至500毫升,文火煮30分钟。另取500 ml水,加入琼脂,加热煮沸至溶解,将两种液体混合均匀,补水,调pH至7.4,分装,灭菌备用。
3.真菌培养基
沙氏培养基的配方
蛋白胨10g琼脂20g
麦芽糖40g水1000ml。
首先,在蛋白胨和琼脂中加入水,然后加热并不断搅拌。琼脂溶解后,加入40克麦芽糖(或葡萄糖),搅拌溶解,然后包装灭菌备用。
这种培养菌株通常用于培养多种真菌。
式II马铃薯糖琼脂培养基
土豆洗净去皮,200克切成小块,加1000毫升水,煮半小时,补足水。在滤液中加入10克琼脂,煮沸溶解,再加入20克糖(培养霉菌用蔗糖,培养酵母菌用葡萄糖),补足水,分装,灭菌备用。
将此培养基的pH值调至7.2 ~ 7.4,配方中的糖如葡萄糖也可用于培养放线菌和芽孢杆菌。
配方豆芽汁培养基
黄豆芽100g琼脂15g。
葡萄糖20g,水1000ml。
黄豆芽洗净,加水煮沸30分钟。用纱布过滤,滤液中加入琼脂,加热溶解后加入糖,搅拌使其溶解,将水补足至1000 ml,包装灭菌备用。
调节这种培养基的pH值到7.2 ~ 7.4,可以用来培养细菌和放线菌。
配方四豌豆琼脂培养基
豌豆80琼脂5g
水200毫升
将80粒干豌豆加水,煮沸65438±0小时,用纱布过滤,滤液加入琼脂,煮沸至溶解,分装,灭菌备用。
4.食用菌培养基
配方1马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
20%马铃薯汁1000毫升
蔗糖20g,琼脂18g。
土豆洗净去皮后,切成小块。称取200克土豆块,加入1000毫升水,煮沸20分钟,然后过滤。将过滤后的汁中的水补足到1000 ml,即制成20%的马铃薯煮汁。在土豆煮汁中加入琼脂和蔗糖,煮沸,使其溶解,加水,包装,灭菌。
配方二马铃薯综合培养基
20%马铃薯汁1000毫升
磷酸二氢钾3g硫酸镁1.5g。
葡萄糖20g,维生素10 mg。
琼脂18g
首先,准备20%煮土豆汁。方法同上。将上述成分加入煮沸的果汁中,加热溶解后加水,调节pH值至6。分装,灭菌备用。该培养基用于培养和保存食用菌如灵芝、平菇和香菇。
5.烟草培养基
在植物组织培养中,通过调节IAA与CTK的比例,愈伤组织可以分化成根或芽。当CTK/IAA较高时,愈伤组织能分化出芽。
当CTK/IAA较低时,根系分化;适度的CTK/IAA比率维持愈伤组织的未分化。
愈伤组织诱导培养基的制备
以MS培养基母液为基础,在干净的铝锅中依次加入大量元素20×母液100mL、微量元素100×母液20mL、铁盐100×母液20mL、维生素100×母液20mL、肌醇200×母液10mL。制备MS培养基后,加入0.5 mg L-1 Ba8ml和0.5 mg L-1 NAA8mL,然后加入约为所制备培养基实际体积2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖,搅拌使其溶解。用0.5摩尔L-1 NaOH和0.5摩尔L-1 HCl调节pH值至5.8-6.0。加入14g琼脂,将铝锅置于电炉中,搅拌加热使琼脂完全溶解,然后用蒸馏水使体积达到2L的最终体积,继续加热几分钟使其混合均匀,然后分装于三角瓶中。
烟草叶片愈伤组织的诱导
取一个无菌培养皿,用手术刀切开1-2无菌苗叶,放入无菌培养皿中,使用溶液
用切割刀将叶片切成2mm2左右的小块,然后接种在准备好的培养基上,每瓶接种。
五小块,一* * *接种6瓶。接种的三角菌在24种条件下在黑暗中培养65438±0周,然后在相同条件下培养
将样品在光照和完全黑暗中培养3周,直到形成愈伤组织(每种情况下3瓶)。
观察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率。
器官分化和植物再生培养
将诱导的愈伤组织根据它们的类型转移到分化培养基上,在连续光照和20-22℃的温度下培养3周,并对愈伤组织的植株再生进行计数。
愈伤组织诱导概况
烟草愈伤组织诱导培养4周后,基本形成愈伤组织,即排除了愈伤组织是生长时间不足造成的
没有形成愈伤组织。详情见表1。在所有六个培养瓶中都形成了愈伤组织,但没有一个发展起来。
污染,但诱导率相差无几。其中,光照条件下培养的三个瓶子的平均愈伤组织诱导率为100%
60.0℅,黑暗条件下培养的三瓶平均愈伤组织诱导率为46.7%。由于实验中的外植体,
烟叶体积太小,接种时部分外植体的大部分细胞可能已经脱水死亡,使整株
本试验的愈伤组织诱导率低,愈伤组织小。
培养基还包括:1640培养基。
特殊介质:
选择性媒介
1酵母增菌培养基
葡萄糖5%尿素0.1%硫化铵0.1%磷酸二氢钾0.25%磷酸氢二钠0.05%七水硫酸镁0.1%七水硫酸铁0.01%酵母抽提物0.05%。
孟加拉红0.003% pH4.5
自养固氮菌在阿什比无氮培养基中的富集培养
甘露醇1%磷酸二氢钾0.02%七水硫酸镁0.02%氯化钠0.02%
二水硫酸钙0.01%碳酸钙0.5%
两种差分介质
EMB培养基,常用于鉴定大肠杆菌
蛋白胨10g乳糖5g蔗糖5g磷酸氢二钾2g曙红Y 0.4g亚甲蓝0.065g
蒸馏水1000g pH7.2
一种分离海洋微生物的培养基配方
2216E培养基配方(固体培养基)
蛋白胨5g
酵母泥1克
0.01克磷酸铁
琼脂15-20g
陈海水1000ml
将氢氧化钠溶液(5%)煮沸,以调节PH值至7.6-7.8。
其他媒体:
1.高的第一介质
KNO3:1g,
氯化钠:0.5克,
磷酸二氢钾:0.5克
硫酸镁·7H2O:0.5g
七水硫酸亚铁:0.01克
可溶性淀粉20g
琼脂20g
蒸馏水1000毫升
调节pH至7.2 ~ 7.4,121℃灭菌30分钟。
方法:先将淀粉用少量水调成糊状,再将700ml水放在电炉上加热煮沸。
然后边搅拌边倒入淀粉糊,同时保持沸腾,再加入其他配料。
溶解后,加水至1000毫升。
肉汤蛋白胨斜面:
蛋白胨10g
牛肉酱5g
蒸馏水1000毫升
氯化钠:5克
Ph: 7.0 ~ 7.2,121℃杀菌20min。
如配制固体培养基需要琼脂1.5%~2%,半固体培养基可添加琼脂0.5%~0.8%。
不同细胞培养基
天然细胞培养基
天然培养基是指来源于动物体液或通过组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚提取液等。在组织培养技术的早期,采用天然培养基进行细胞的体外培养。但由于生产工艺复杂,批次间差异大,天然培养基逐渐被合成培养基取代。目前广泛使用的天然培养基是血清,各种组织提取物和促进细胞黏附的胶原物质在一些特殊细胞的培养中也是必不可少的。
血清类型
目前用于组织培养的血清主要是牛血清,一些特殊细胞也用人血清、马血清等进行培养。选择牛血清进行细胞培养的原因是:来源充足,制备技术成熟,经过长时间的应用试验,人们对其有了更深入的了解。牛血清适用于大多数哺乳动物细胞,但不排除在培养某些细胞时使用其他动物血清更合适。
牛血清是细胞培养中使用最多的天然培养基,含有丰富的细胞生长所必需的营养物质,具有极其重要的功能。牛血清可分为小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。胎牛血清应通过剖腹产取自胎牛。新生牛血清取自出生后24小时内的新生牛;小牛血清取自出生于10-30天的小牛。显然,胎牛血清的质量是最高的,因为胎牛没有接触过外界,血清中含有的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
血清的主要成分
血清是一种非常复杂的混合物,通过从血浆中去除纤维蛋白而形成。虽然其成分大部分已知,但仍有部分未知,血清的成分和含量往往随献血者的性别、年龄、生理状况和营养状况而变化。血清中含有各种血浆蛋白、肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。,它们在促进细胞生长或抑制生长活性方面处于生理平衡。
血清的主要作用
1.提供基础营养素:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等。,是细胞生长的必需物质。
2.提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子,如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
3.提供结合蛋白:结合蛋白用于携带重要的低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪和激素,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢中起重要作用。
4.提供接触促进和拉伸因子,以防止细胞粘附受到机械损伤。
5.对培养中的细胞有一定的保护作用:有些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞等,能释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起中和作用。这种效应是偶然发现的,现在有目的地用血清来阻止胰蛋白酶的消化。因为胰蛋白酶已经广泛用于贴壁细胞的消化和传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤。尤其在悬浮培养中,粘度起着重要的作用。血清中还含有一些微量元素和离子,对新陈代谢和解毒有重要作用,如SeO3和硒。
血清培养基的主要问题
1.血清成分可能有数百种,但确切的组成成分、含量和作用机制尚不清楚,尤其是一些多肽生长因子、激素和脂类等还不完全了解,给研究工作带来很多困难。
2.血清是批量生产的,批次之间差异很大,血清的保存期最多一年。因此,保证每批血清的相似性极其困难,限制了实验的规范性和连续性。
3.对于大多数细胞来说,在体内,血清并不是它们接触的生理液体,只是在损伤愈合和血液凝固的过程中,所以使用血清可能会改变体内某些细胞的正常状态,血清可能会促进某些细胞(成纤维细胞)的生长,抑制另一类细胞(表皮细胞)的生长。
4.血清中含有一些对细胞有毒性的物质,如多胺氧化酶,可与高增殖细胞产生的多胺(如精胺、亚精胺)反应,形成具有细胞毒作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素都会影响细胞生长,甚至导致细胞死亡。
5.不同动物的血清来源和批号不同,每批质量差异很大,其成分不可能一致。
6.支原体和病毒可能被带入样品,对细胞有潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠。
7.在大规模生产中,血清的来源越来越困难和昂贵,这是动物细胞培养生产成本的主要部分之一。
血清质量标准
血清的质量取决于两个因素:一是取样对象,二是取样过程。用于取样的动物应健康无病,并在规定的出生日期内。采样过程要严格按照操作规程进行,制备的血清要经过严格的质量鉴定。世卫组织颁布的《动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:
1.牛血清必须来自牛或有文件证明没有牛海绵状脑病的国家,并应有适当的监测系统。
2.一些国家还要求牛血清来自从未使用过反刍动物蛋白饲料的牛。
3.证明所用的牛血清不含所产生疫苗病毒的抑制剂。
4.血清要用过滤膜灭菌,保证无菌。
5.无细菌、霉菌、支原体和病毒污染,部分国家要求无噬菌体污染。
6.有很好的支持细胞繁殖的效果。
我国在2000版《中国生物制品主要原料及辅料质量控制标准》中对牛血清的质量提出了严格的标准,包括蛋白质含量、细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。