你对ELISA实验的注意事项了解多少
标本的收集和保存
通常，我们可以用于ELISA检测的样品类型有很多种，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清液或组织匀浆等。不同类型的检测样品有不同的预处理方法。正确处理样品是保证ELISA检测正确性和准确性的第一步。下面简单介绍不同类型样品的处理方法。
血清
血清是ELISA检测最常用的样品，其处理相对简单。
用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血样，将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜，使血清沉淀。(最好将试管或离心管倾斜放置，增加液面横截面，可以更大程度沉淀血清。)4℃1000×g离心20min，小心收集上清液。建议将血清分成多份保存在-20℃或-80℃下，避免反复冻融。
采血过程中应避免溶血，因为红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，HRP标记的ELISA检测会出现非特异性显色，导致检测不准确。同时也要避免细菌污染，因为细菌中可能含有内源性HRP，可能导致假阳性检测。
血浆
用采血管或含抗凝剂的离心管采集血液样本，采集样本后30分钟内4℃离心1000×g 15分钟，取上清液作为血浆。将上清液分成多份，保存于-20℃或-80℃，避免反复冻融。避免使用溶血性或高脂血症样本。
常用的抗凝剂有EDTA、肝素钠和柠檬酸钠等。检测时，还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。
细胞培养上清液
取细胞培养上清液至离心管，1000×g离心20min，去除细胞碎片和杂质，取上清液，保存于-20℃或-80℃下，避免反复冻融。
细胞裂解物
1)吸取培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，加入适量培养基将细胞吹离培养板。悬浮细胞可以省略。
2)收集细胞悬液，1000×g离心10分钟，弃去培养基，用预冷的PBS湿润三次。
3)加入适量预冷的PBS或细胞裂解物(使用前加入蛋白酶抑制剂)以重新悬浮细胞。通常，6孔板的一个孔中的细胞量需要150~250μL PBS来重悬。
4)将样品置于-20℃或-80℃冷冻，再置于室温解冻，反复冷冻数次，使细胞充分裂解。也可以通过超声波破碎样品，达到裂解的目的。
5)4℃离心10000×g 10分钟，去除细胞碎片，取上清液，保存于-20℃或-80℃，避免反复冻融。
组织匀浆
1)用PBS (0.01M，PH 7.4)冲洗组织样本，洗掉组织表面残留的血液或杂质。
2)称取组织块，记录并切成块。碎片要越小越好，这样才能均匀的更充分。
3)将组织按一定比例加入预冷的PBS(使用前加入蛋白酶抑制剂)进行匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴上。(通常组织重量:PBS体积等于1: 9，如1g组织样本对应9mL PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后样本浓度应乘以相应的稀释倍数)。
4)将匀浆吸取至离心管中，4℃5000×g离心5~10min，取上清液，保存于-20℃或-80℃下，避免反复冻融。
尿液、唾液和其他液体生物样本
用1000×g离心20min，取上清液检测。
一般来说，由于ELISA只能检测可溶性蛋白的含量，所以要保证所有样品都是澄清的液体，要通过离心去除沉淀物或悬浮物。
为保证检测的准确性，储存于-20℃或-80℃的样品应在1~6个月内进行检测。储存在4℃的样品应在1周内进行检验。
此外，还要保证样品中不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性结果。
试剂的制备
按照试剂盒说明书的要求，准备好实验所需的试剂。ELISA中使用的蒸馏水或去离子水，包括洗涤，应该是新鲜的高质量的。自制缓冲液和洗涤液用酸度计测量。从冰箱中取出的检验试剂应在温度和室温平衡后使用，室温平衡一般不少于30min。试剂盒中不需要的部分应及时放回冰箱保存。
加样
在ELISA中，加样一般有三个步骤，即加样、加酶结合物、加底物。加样时，所加物质应加到雷萨板孔底，避免加到孔壁上部，注意不要溢出或产生气泡。
标本一般用微量取样器加入，按规定量加入板孔。每次加样都要更换吸嘴，避免交叉污染，也可以用一次性定量塑料管加样(一般不推荐)。有些指标(如间接ELISA)需要稀释血清，可以在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可以在板孔中加入稀释液，再加入血清样本，然后在微型摇床上摇匀1min。添加酶结合物工作液和底物工作液时可使用多通道移液器，使加液过程在最短时间内完成。
热绝缘
ELISA中一般有两个抗原抗体反应，即加入样品和酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要一定的温度和时间。这个保温过程叫做孵化，也有人称之为孵化。
ELISA是一种固相免疫分析，抗原和抗体的结合只发生在固相表面。以抗体包被的夹心法为例。加入板孔的样品中，并非所有抗原都有均等的固相抗结合机会，只有最靠近孔壁的那层溶液中的抗原与抗体直接接触。这是一个逐渐平衡的过程，所以需要扩散才能达到反应的终点。酶标抗体与固相抗原的结合也是如此。这就是为什么ELISA总是需要一定时间的孵育。
孵化常用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)。37℃是实验室常用的温度，也是大多数抗原和抗体结合的适宜温度。建立ELISA方法研究反应动力学时，两种抗原抗体反应在37℃下通常需要1-2小时，产物可达峰值。为了加速反应，可以提高反应温度。有些实验在43℃下进行，但更高的温度是不合适的。抗原和抗体在4℃反应更彻底，放免检测中反应往往在冰箱中过夜，形成最多沉淀。但由于耗时太长，一般不用于ELISA。
除了一些带有专用电加热块的ELISA仪器外，一般采用水浴保温。酶标板可以放在水浴箱中，酶标板的底部要贴在水面上，这样可以快速平衡温度。为了避免蒸发，要把板盖上，板的孔也可以用塑料密封纸或保鲜膜盖住，使反应板浮在水面上。如果使用培养箱，酶标板应放在湿盒中。湿箱要用金属等导热性好的材料制作，箱底要垫湿纱布。最后，酶标板要放在湿纱布上。湿箱要在培养箱里预热到规定的温度，尤其是温度低的时候。为了避免酶标板底部水汽或磨损造成读数误差，一般用鼓风机恒温保温。在这个过程中，必须在酶标板上方粘贴纸张，避免蒸发。无论是水浴还是湿箱孵育，反应板都不要叠放，以保证每块板的温度能快速平衡。对于室温孵育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内。标准室温是指20-25℃，但具体操作可根据说明书要求控制。在室温下孵育时，酶标板只能平放在操作台上。需要注意的是，孵化的温度和时间要按照规定尽量准确。为了保证时间准确，一个人不要同时操作和测量两块以上的板。
洗涤
虽然洗涤不是ELISA中的反应步骤，但也决定了实验的成败。ELSIA可以通过洗涤分离游离和结合的酶标记。通过洗涤，去除了残留在板孔中的不能与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附在固相载体上的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍的，洗涤时要洗掉这种非特异性的吸附干扰物质。可以说，洗涤是ELISA操作中最重要的关键技术，应引起操作人员的高度重视，严格按照要求进行洗涤，不可马虎。
除了一些ELISA仪器配有专门的自动洗涤仪器外，还有两种洗涤方式:浸泡和流水洗涤。流程如下:
(1)浸没式:a .吸收或甩干孔中的反应溶液；b .用洗涤液过洗(洗涤液灌满板孔后，扔掉)；c)浸泡，即将板孔注满洗涤液，静置1-2min，间歇摇动，浸泡时间不能随意缩短；吸干洞里的液体。吸要彻底，可以用水泵或真空泵吸，也可以在液体倒掉后用干净的毛巾或吸水纸拍干；e .重复操作c和d，洗涤3-4次(按照说明中的规定)。在间接法中，如果背景高，可以增加洗涤次数或浸泡时间。
浸泡洗涤法常用于微量滴定板。洗涤液主要是含有非离子洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体和蛋白质的结合是疏水的。非离子去污剂既含有疏水基团又含有亲水基团，其疏水基团通过疏水键与蛋白质的疏水基团结合，从而削弱了蛋白质与固相载体的结合。借助亲水基团和水分子的结合，蛋白质恢复到水溶液状态，从而与固相载体分离。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般为吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间。当高于0.2%时，包被在固相上的抗原或抗体会被解吸，从而降低测试的灵敏度。
(2)流水冲洗法:流水冲洗法最初用于清洗珠载体，洗涤液仅为蒸馏水甚至自来水。洗的时候附一个特殊的装置，让珠子在流水的冲击下不断滚动。连续冲洗2分钟后，将液体沥干，然后在蒸馏水中浸泡2分钟，然后沥干。浸泡就像洗澡，流水冲洗就像淋浴。其洗涤效果更彻底，简单快捷。现有的实验表明，流水洗涤也适用于洗涤微量滴定板。清洗时尽量加大水流或水压，使水流冲击板孔表面，清洗效果更好(这种方法在套件中很少使用)。
显色和色度学
着色
显色是ELISA中最后的孵育反应，此时酶催化无色底物产生有色产物。反应温度和时间仍然是影响显色的因素。在一定的时间内，阴性毛孔可以保持无色，而阳性毛孔随着时间的推移会变得更有颜色。适当提高温度有助于加速显色。定量测定时，加入底物后的反应温度和时间应尽可能准确。定性测定的显色可在室温下进行，时间一般不需要严格控制。有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况，适当缩短或延长反应时间，以便及时判断。
一般OPD底物在室外温度或37℃下反应20-30分钟后显色不会加深，延长反应时间背景值会增大。OPD的底物溶液遇光会自行变色，显色反应要在暗处进行。在显色反应结束时，通过加入终止溶液来终止反应。在OPD产物用硫酸终止后，颜色从橙色变为棕色。
TMB不受光的影响，所以它可以在室温下放在手术台上，反应时可以观察结果。但为了保证实验结果的稳定性，宜在适当的时候读取结果。TMB经HRP处理后，40分钟左右显色达到高峰，随后逐渐减弱，2小时后完全消失至无色。TMB的终止溶液有很多种，叠氮化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂可以终止反应。这种终结者可以长时间保持蓝色(12-24小时)，是视觉判断的好终结者。此外，各种酸性终止液都会由蓝色变为黄色，此时可在特定波长(450nm)下测得吸光度。
【化学】色度的……
比色前要用干净的吸水纸吸干附着在板底部的液体，但尽量避开表面，然后将板正确放置在酶标比色计的比色架上。以软板为载体的实验，要把板放在标准的96孔台座上，才能进行比色。最好在加入底物溶液显色前，将软板的边缘切掉，使板完全坐入座架内。
比色时，先用蒸馏水校准零点，测量并读取底物孔(只加入底物液而不发生任何反应的孔)和空白孔(全程用生理盐水或稀释液代替样品的孔)，记录本次试验的试剂状态。之后可以用空白孔用蒸馏水校准零点，用空白孔的吸光度减去上述孔的吸光度，然后计算。
比色结果的表达以前是光密度(OD)，现在按规定用吸光度(A)，意思一样。通常的表示方法是将吸收波长写在字母a的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为“A492nm”或“OD492nm”。
酶标记比色计
酶标比色仪，简称酶标仪，通常是指专用于测量ELISA结果吸光度的光度计。根据固体载体的不同形式，有适用于平板、珠子和小试管的特殊设计。很多试剂公司供应酶标仪器。酶标仪的主要性能指标有:读数速度、读数准确度、重复性、准确度和可测范围、线性度等。一个优秀的酶标仪的读数一般可以精确到0.0 01，准确度1%，重复性0.5%。例如，如果某孔的实测A值为1.083，则该孔相对于空气的真A值应为1.083 0.01(1.073 ~ 1.093)，重复测量后其A值应为1。酶标仪的可测范围因每台酶标仪的性能而异。一般的酶标仪是0.000~2.000，新的酶标仪上限被拉大到2.900甚至更高。超过可测量上限的值通常用“*”或“超过”或其他符号表示。我们要注意可测范围和线性范围的区别，后者往往小于可测范围。比如一个酶标仪的可测范围是0.000~2.900，而它的线性范围只有0.000~2.000，这是定量ELISA做标准曲线时要注意的。
酶标仪不应放置在阳光下或强光下，操作时室温应在15~30℃。使用前将读数器预热15-30分钟，这样读数结果会更稳定(部分酶标仪说明书明确注明不需要预热)。
读取A值时，应选择产品灵敏的吸收峰，如波长为492nm的OPD。有些酶标仪可以使用双波长读数，即每个孔读两次，第一次在最佳波长(W1)，第二次在不敏感波长(W2)，两次测量之间酶标板的位置不移动。比如OPD用492nm作为W1，用630nm作为W 2，最后测得的A值就是两者之差(W1-W2)。双波长读取可以减少容器上的划痕或指纹造成的光学干扰。
各种酶标仪器的性能不同，使用时记者的说明要详细。
结果判断
定性测定
定性判定的结果是对被检标本是否含有待检抗原或抗体给出“是”或“否”的简单回答，分别用“阳性”和“阴性”表示。“阳性”表示样本在测定系统中有反应。“否定”表示没有反应。定性判断也可以得到半定量的结果，即用效价来表示反应的强度，本质上还是定性检验。在这种半定量测定中，将样品进行系列稀释并进行检测，阳性反应的最高稀释度为效价。根据滴度可以判断样本的反应性，这比观察未稀释样本的颜色深浅来判断是强阳性还是弱阳性更具有定量性。
在间接法和夹心法ELSIA中，正孔的颜色比负孔的颜色深。相反，在竞争ELISA中，阴性孔的颜色比阳性孔的颜色深。两种反应的结果以不同的方式判断，如下所述。
(1)间接法和三明治法
这类反应的定性结果可以用肉眼判断。如果目测标本无色或接近无色，则判定为阴性，如果颜色清晰，则为阳性。但在ELSIA中，正常人血清反应后常出现一种有色背景，这种背景的深浅随试剂组成和实验条件而异，所以实验中必须加入阴性对照。阴性对照的成分应为正常血清或不含受试物质的类似物。用肉眼判断结果时，用比阴性对照暗的颜色作为标本的阳性指标更为合适。
目测法简单明了，但相当主观。在条件允许的情况下，用色度计测定吸光度值，这样可以得到客观的数据。首先读出样品(S)、阳性对照(P)和阴性对照(N)的吸光度值，然后计算。计算方法很多，大致可分为两类:阳性判定值法和标本与阴性对照比值法。
A.积极判断值
一般阳性临界值是阴性对照A值加上一个特定的常数，作为判断结果是阳性还是阴性的标准。
用这种方法判断结果，要求实验条件非常恒定，试剂的配制必须规范，正负对照品要符合一定的规范，必须使用精密仪器，严格按照规定操作。阳性判定值公式中的常数是通过对这一特定体系中大量标本的实验检测得到的。我们以检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品中HBsAg的含量标注为P = 9±2 ng/ml。每个实验有2个阳性对照和3个阴性对照。测量A值后，首先计算阴性对照A值(NC X)的平均值和阳性对照A值(PCX)的平均值，两个平均值之差(P-N)必须大于特定值(例如0.400)测试才有效。三个阴性对照的a值应≥0.5×NCX且≤1.5×NCX。如果其中一个超出此范围，则应将其丢弃，并使用另外两个阴性质控品重新计算ncx。如果两个阴性对照的一个值超过上述范围，实验无效。根据以下公式计算阳性判断值:
正面判断值=NCX+0.05
A值大于阳性判断值的标本为阳性，A值小于阳性判断值的标本为阴性。需要注意的是，公式中的0.05是试剂盒的常数，只适用于这种特定的条件，并不通用于各类试剂。
根据以上描述，可以看出，阴性对照和阳性对照在该方法的检验质量控制中也发挥作用，试剂变质和操作不当都会导致“检验无效”的后果。
B.样本/阴性质控比率
当实验条件(包括试剂)难以保证恒定时，这种判断方法更为适用。获得样本和阴性对照的A值后，计算S/N值。还有人写P/N，这里P不是代表阳性，而是patient的缩写，不要误解。为了避免混淆，用s/n更合适，在早期的间接ELISA中，有作者将S/N定为阳性标准，现在常用于各种检测。事实上，每个测量系统都应该通过实验找到自己的信噪比阈值。应当注意，用n表示的阴性对照是不含受试物质的人血清。某些试剂盒中的阴性对照是不含蛋白质或含蛋白质的缓冲液，因此反应后产生的背景可能比正常人血清低得多。因此，这样的试剂盒规格，如N
(2)竞争法
竞争法ELISA中，阴性孔的颜色比阳性孔的颜色深。负显色的强度取决于酶缀合物的浓度和反应中加入的竞争抑制剂的量。一般阴性对照的吸光度调整在1.0-1.5之间，此时反应最灵敏。
竞争ELISA不太容易通过自身观察判断结果，因为肉眼很难分辨弱阳性反应和阴性对照的颜色差异，一般通过比色计读出S、P、n的吸收值来确定，主要有两种计算方法，即阳性判断值法和抑制率法。
A.正判断值法
与间接法和夹层法中的阳性判定值法基本相同，只是在计算公式中引入了阳性对照A值。现在以检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗-HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗-HBc含量为125 100u/ml。每个实验有2个阳性对照和3个阴性对照。测量A值后，首先计算阴性对照A值(NC X)的平均值和阳性对照A值(PCX)的平均值，两个平均值之间的差值(N-P)必须大于特定值(例如0.300)，测试才有效。三个阴性对照的a值应小于2.000，且应≥0.5×NCX且≤1.5×NCX。如果其中一个超出此范围，则应丢弃，并用另外两个阴性对照重新计算× ncx。如果有两个阴性对照A超出上述范围，实验无效。根据以下公式计算阳性判断值:
否定判断值=0.4×NCX+0.6×PCX
a值≤正判断值的反应为正，a >正判断值的反应为负。
B.抑制率法
抑制率表示竞争性结合中阴性反应显色的抑制程度，计算如下:
抑制率(%) =(阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照A值。
一般来说，抑制率≥50%为阳性，< 50%为阴性。
定量测定
ELSIA的操作步骤复杂，影响反应的因素很多，尤其是固体载体的包衣很难达到个体间的一致性。因此，在定量测定时，每批试验必须用一系列不同浓度的参考标准在相同条件下制作标准曲线。测定高分子量物质的夹心ELISA一般有较宽的标准曲线范围，曲线最高点的吸光度可接近2.0。绘图时常用半对数纸，以被测物质的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，将各浓度值逐点连接。得到的曲线一般呈S形，其头尾曲线趋于平缓，中间的直线部分是最理想的检测区域。
竞争法常用于测定小分子量物质，其标准曲线中的吸光度与被测物质的浓度呈负相关。由于试剂盒中使用的型号不同，标准曲线的形状略有不同。